در Assassin’s Creed: Brotherhood، اتزیو (Ezio Auditore da Firenze) بازگشته است. فردی که پس از غلبه بر عاملان قتل پدرش جیووانی آدیتوره (Giovani Aditore da Firenze) و پیوستن به فرقه‌ی قاتلان (Assassins) پا به شهر رم (Rome) گذاشته است. کسی که پس از وقایع نسخه‌ی قبل به قاتلی ماهر و چیره دست تبدیل شده است.

کسی که نامش لرزه بر اندام Templarها که دشمنان اصلی وی به حساب می‌آیند می‌اندازد. وی بازگشته تا کسانی که ریشه‌ی فساد و تباهی و قتل و غارت را در رم گسترانیده‌اند از بین ببرد.بازی در سال ۱۵۰۳، مدت کوتاهی پس از اتفاقات رخ داده در AC II آغاز می‌شود. شهر Monteriggioni تحت محاصره‌ی نیروهای سربازان Borgia درآمده که رهبری آنها را Cesare Borgia، پسر Rodrigo (که Ezio در آخر بازی قبل وی را به قتل رساند) بر عهده دارد.

در این هنگام مردم Monteriggioni که خطه‌ی خود را مورد تجاوز می‌بینند بر علیه نیروهای Borgia دست به شورش می‌زنند و در پی این درگیری‌ها Mario عموی اتزیو به قتل می‌رسد. این خبر بهانه‌ای می‌شود تا اتزیو که حالا به فرد میان سالی تبدیل شده گرد از شمشیر و سپرش بروبد و عازم رم شود تا رهبر Templar‌ها یعنی Cesare را به سزای عملش برساند اما وی در گذر از این راه صعب العبور تنها نیست و دوست و یاران هیشگی وی یعنی Niccolò Machiavelli که یکی از عناصر سیاسی مهم ایتالیا بشمار می‌آید، Caterina Sforza که حاکم شهر Forli است و البته Leonardo da Vinci که بزرگترین مخترع جهان در آن زمان به حساب می‌آید وی را در نایل آمدن به هدفش یاری می‌کنند.

البته اتزیو یک برتری دیگر هم دارد وی قادر است تا افرادی را استخدام و تربیت کند، این افراد که قاتلان جوان (Young Assassins) نام دارند پس از کسب تجربه‌ی کافی از اتزیو، در سراسر رم ماوا گزیده‌اند و منتظرند تا در صورت جنگ و درگیری بی درنگ به یاری اتزیو بشتابند.